原代細胞的分離和制作

人或動物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細胞結(jié)合緊密，不利于各個細胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長，若需獲取大量細胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細胞解離出來，常采用的方法如下：

一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長離心時間，但速度不能太高，延時也不能太長，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當細胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。 

二、實體組織材料的分離方法 
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。
（一）機械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

（二）消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。

1、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：
（1） 胰蛋白酶分散技術(shù) 
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。
①細胞類型 胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時活力高。
該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結(jié)團塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進細胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時活性相對于高于其他溫度，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進行消化比室溫作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來，消化分離細胞時PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細胞有損傷。
⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時間 如果細胞消化時間過長，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時間為20分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于4℃過夜也可。
分離方法如下：
①過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細胞計數(shù)，按適當?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：
熱消化多次提取 將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作，再消化提取細胞。
冷消化多次提取 方法同上，只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化 將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過夜，次日再提取細胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。

（2） 膠原酶（Collagenase）消化法 
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無需機械振蕩，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。
經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被*消化開。成小團塊的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此不必要再進一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學活性（見表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間（小時）有差異（見表4-2），以及兩者價格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時還可加透明質(zhì)酸酶（對細胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
項 目 胰蛋白酶 膠原酶
消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織
用 量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL(200u/mL)
消化時間 0.5～2小時（小塊） 1～12小時
pH 8～9 6.5～7.0
作用強度 強烈 緩和
細胞影響 時間過長有影響 無大影響
血清、鈣、鎂離子 有影響 無影響

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5～1cm3)
酶 種 類 較 硬 組 織 軟 組 織
4℃ 室 溫 37℃ 4℃ 室 溫 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1
膠原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
兩者聯(lián)合 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2

除上述兩種消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟：
（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基。
（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。
注意事項如下：
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。