143B人骨肉瘤細(xì)胞系

143B人骨肉瘤細(xì)胞系

無菌操作基本技術(shù) 
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(至少Class II)。
5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

1、請(qǐng)問工作濃度的胰酶是不是應(yīng)保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個(gè)小時(shí)就會(huì)失去活性？
平時(shí)放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時(shí)拿一管放4度用。
2. 粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個(gè)月，如在-20度存放時(shí)間可長(zhǎng)一些，但*也不要超過3-4個(gè)月，可能對(duì)于永生化細(xì)胞株來說要求不是太高，細(xì)胞嬌弱，經(jīng)驗(yàn)表明放置時(shí)間不宜過長(zhǎng)。認(rèn)真按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一般不大會(huì)導(dǎo)致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養(yǎng)基有污染而使實(shí)驗(yàn)失敗，
 3. 關(guān)于實(shí)驗(yàn)用品的清洗與消毒，我的經(jīng)驗(yàn)是：用過的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過夜)后，自來水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。
許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養(yǎng)瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當(dāng)然如果money有限，如進(jìn)口的培養(yǎng)板、皿等，也可以重復(fù)使用1-2次，我當(dāng)時(shí)使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現(xiàn)問題。塑料培養(yǎng)瓶由于清洗消毒不便，*不要重復(fù)使用，如一定要重復(fù)用，可用環(huán)氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)。

在光鏡下，上皮細(xì)胞通常呈“鋪路石”樣排布，細(xì)胞之間有拉絲現(xiàn)象（即距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞可以通過細(xì)長(zhǎng)的觸手相連），細(xì)胞有成片生長(zhǎng)的特性。而間質(zhì)細(xì)胞通常呈梭形，沒有有成片生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細(xì)胞的形態(tài)特征會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)條件的改變而改變，如HeLa細(xì)胞是上皮細(xì)胞，但是在酸性培養(yǎng)條件下會(huì)變?yōu)樗笮巍Ｉ掀ぜ?xì)胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結(jié)構(gòu)，因此可以通過觀察培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)來判斷細(xì)胞的類型，如果有緊密連接，就必然是上皮細(xì)胞。這是一錘定音的證據(jù)。注意不要把細(xì)胞消化下來做電鏡，要用細(xì)胞刮刮下來后做電鏡。此外每一種上皮細(xì)胞都有其特征的細(xì)胞角蛋白的表達(dá)（cytokertin, CK）,可以查一下子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞表達(dá)的CK分子，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)的鑒定。
細(xì)胞在偏堿的情況下培養(yǎng)，耐受能力會(huì)逐漸下降，可能是產(chǎn)生脫壁現(xiàn)象的原因，后來我重新測(cè)了一下培養(yǎng)基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調(diào)了一下，培養(yǎng)基顏色變成淡紅透亮，再次培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁比較好了，搏動(dòng)效果也不錯(cuò)，因此，我以后每次培養(yǎng)前都要重新調(diào)好PH值，我覺得很多因素是能影響PH值的。
血清質(zhì)量不好，影響了細(xì)胞生長(zhǎng)。所以，我認(rèn)為以后養(yǎng)細(xì)胞，用的血清濃度*是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻(xiàn)為準(zhǔn)，畢竟國(guó)產(chǎn)的血清質(zhì)量差異比較大啊。
細(xì)胞無菌操作是關(guān)鍵，對(duì)于配制培養(yǎng)液時(shí)，有些人為了讓培養(yǎng)粉充分溶解，攪拌4小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。其實(shí)這*沒有必要，一般培養(yǎng)基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)增加污染機(jī)會(huì)，雖然后來濾過除菌了，但細(xì)菌的代謝產(chǎn)物比如脂多糖誰能夠把它濾掉？細(xì)菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經(jīng)驗(yàn)就是攪拌30min-60min就把它過濾。
另外關(guān)于培養(yǎng)基的pH問題，一般按照說明書操作，加入所說的NaHCO3量，與預(yù)計(jì)的pH不會(huì)有什么距離，也就是說基本上不用調(diào)pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質(zhì)量是否有所下降，當(dāng)然這時(shí)調(diào)pH也是不得已而為之。我配培養(yǎng)基時(shí)基本上不調(diào)pH，只是用試紙檢測(cè)一下pH，觀察一下培養(yǎng)基的顏色。

（1）東西一定要用自己的。既不要借別人的，也不要借給別人。可能大家覺得比較自私。實(shí)際上還是很有好處的。并不是每個(gè)人的操作都規(guī)范，因此相互之間串著用，很容易造成交叉污染。
（2）我習(xí)慣口對(duì)口倒液體，在倒前倒后都要在酒精燈上過一下。自己認(rèn)為比起用吸管吸更能很好的防止污染。步驟越簡(jiǎn)單，越能防止污染。而且還能節(jié)省很多吸管。
（3）一次將所有的所需要試劑、工具放入工作臺(tái)。不要做到半路，又出工作間拿東西，這樣增加了污染的機(jī)會(huì)。
（4）整個(gè)操作要快、動(dòng)作要輕、而且不要干其他的事情。比如手機(jī)響了，*不要接。我一般操作的時(shí)候?qū)⑹謾C(jī)關(guān)了，手機(jī)聲音響起，好煩躁。
（5）我一般開紫外線照射臺(tái)的時(shí)候，就將培養(yǎng)基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細(xì)菌。因此用它的也一定要勤換水。從水域鍋那出后，*找個(gè)毛巾插干上面的水。
（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作臺(tái)，要打掃衛(wèi)生。
細(xì)胞要經(jīng)常凍存，我一般只要細(xì)胞狀態(tài)好就將細(xì)胞凍存起來。細(xì)胞狀態(tài)差了，扔掉，重新復(fù)蘇。這是一個(gè)必須養(yǎng)成的習(xí)慣。畢竟很多情況下，細(xì)胞并不是因?yàn)槲廴玖?，才讓你感到頭痛。這樣你不會(huì)擔(dān)心沒有種子了。我一般是不加雙抗的，只要注意，不會(huì)污染。

過濾時(shí)不要用槍吹細(xì)胞!! 如果用力吹,篩網(wǎng)就像刀片一樣,把你的細(xì)胞全部切碎!!

.刷玻璃器皿的過程：初洗、泡酸（一天）、自來水沖洗（10遍）、純化水沖洗（3遍）、注射用水沖洗（3遍）。感覺過于苛刻，自來水只沖洗3遍。被老師發(fā)現(xiàn)后，一陣痛批，才知道這是極其關(guān)鍵的一步，殘留的酸可能會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，痛失辛苦得來的細(xì)胞，心血付之東流。無知不能無畏，一定不能大意。

做好準(zhǔn)備工作。不要急于投身到細(xì)胞培養(yǎng)中去，要先設(shè)定計(jì)劃：步驟，工具，試劑。特別是將細(xì)胞用于大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，尤其如此。經(jīng)過干熱滅菌的容器一般認(rèn)為可以在一周內(nèi)保持無菌狀態(tài)，如果準(zhǔn)備多了，用不完的就得重新滅菌，耗費(fèi)能源、占用滅菌空間，不值得；干熱滅菌需要一天的時(shí)間，當(dāng)器皿準(zhǔn)備不足時(shí)，只能干著急，錯(cuò)過了蕞佳操作時(shí)間，也許得很久才能將細(xì)胞狀態(tài)再調(diào)整好。

對(duì)于驕氣的細(xì)胞，我一般都是*天處理完后，加少量培基（夠蓋住瓶底部），第二天換液，以免死細(xì)胞和碎片對(duì)活的產(chǎn)生不良影響。

新配的培養(yǎng)基直接用很清亮，但是在－20度保存一段時(shí)間后再溶解就要出現(xiàn)很多雜質(zhì)，用37度水孵育沒有效果，握在手里不停搖動(dòng)非常有效。其實(shí)對(duì)于操作熟練的人來說，污染并不是我們想像那樣容易出現(xiàn)，園子里很多人都問否污問題，而培養(yǎng)基的PH值往往被忽略，而且大多數(shù)人都習(xí)慣于一次配制1升培養(yǎng)基，分裝成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出現(xiàn)結(jié)晶，鏡下看就是一些桿狀的物資，有時(shí)候晃動(dòng)培養(yǎng)基，肉眼就可以看到很多沉淀，這就需要我們?cè)谟弥昂煤脫u勻了。

細(xì)胞凍存： 當(dāng)細(xì)胞細(xì)胞狀態(tài)好，或者代數(shù)比較早，一定要大量?jī)龃?，不要吝惜暫時(shí)的大批使用血清，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不好，長(zhǎng)不起來的時(shí)候，馬上取出來復(fù)蘇，省時(shí)省力，不要去嘗試努力恢復(fù)狀態(tài)不好的細(xì)胞，費(fèi)時(shí)間也費(fèi)血清，會(huì)令你痛苦不堪。另外凍存的細(xì)胞不要放到一個(gè)地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一點(diǎn)，誰也不敢保證不出意外，冰箱也可能有化的時(shí)候（我們－20度冰箱就化過），都放在一塊容易全軍覆沒。 

按照試劑的保存標(biāo)準(zhǔn)保存，像血清、胰酶等沒開封的-20℃，開封后-4℃保存一般不超過7天（用完它吧，不然浪費(fèi)了）
5、一定要弄清楚每個(gè)組分的作用，特點(diǎn)，比如NaHCO3容易分解，因此培養(yǎng)基在過濾除菌時(shí)pH會(huì)上升，一般是0.1-0.3，所以在過濾之前，要把培養(yǎng)基的pH調(diào)低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特點(diǎn)，就不會(huì)做相應(yīng)的處理，那么培養(yǎng)基不符和要求，細(xì)胞就長(zhǎng)不好
臺(tái)盼藍(lán)主要用來鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),細(xì)胞分離后的存活情況，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察即可，活細(xì)胞不被染色。方便易用，因此在實(shí)驗(yàn)室中比較常用，尤其在心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)中。