JHH-4肝癌細(xì)胞

關(guān)于培養(yǎng)瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基的量的問題。
這個(gè)是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長得比較好。（可能也是競爭很大，有優(yōu)勝劣汰吧。呵呵。）對(duì)于生長速度快的細(xì)胞，易生長的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好。但是要注意換液掌握。
關(guān)于選擇培養(yǎng)瓶的問題。
個(gè)人發(fā)現(xiàn)生長速度快的細(xì)胞在玻璃瓶內(nèi)生長的狀態(tài)會(huì)比一次性塑料瓶相對(duì)好一些。而對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶內(nèi)的生長狀態(tài)也比塑料瓶內(nèi)好。這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁。生長速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)“更安逸”的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好，對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞，玻璃瓶則會(huì)更好。同樣，對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì)好一點(diǎn)，比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候，或者原代培養(yǎng)的時(shí)候。而在其生長旺盛的時(shí)候，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。

JHH-4肝癌細(xì)胞

消化/傳代。

1、移去MEF培養(yǎng)基

2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細(xì)胞(以去除胰蛋白酶的抑制物)。

3、每個(gè)培養(yǎng)瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA(0.05%的胰蛋白酶)，消化5min。

4、為了使細(xì)胞分散開，輕輕吹打細(xì)胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

6、將細(xì)胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細(xì)胞分散為單個(gè)的。

7、在新的T75培養(yǎng)瓶中加入10mlMEF培養(yǎng)基。

8、將細(xì)胞懸液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中，放在37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)的胰酶消化法：

傳代培養(yǎng)：是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。

實(shí)驗(yàn)步驟：① 入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;

② 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液37℃下預(yù)熱。

③ 超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;

④ 打開超凈工作臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)清潔空氣除去臭氧;

⑤ 點(diǎn)燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。

⑥ 將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

⑦ 倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。

⑧ 每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，小培養(yǎng)瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。

⑨ 加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

⑩ 對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做。直接將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。